Abstract:

Versione in italiano:

L’epilessia è un disturbo neurologico caratterizzato da crisi epilettiche ricorrenti. Sono disponibili diversi approcci terapeutici ma, purtroppo, circa il 30% dei pazienti non risponde ai trattamenti farmacologici. Nell’ultimo decennio, l’optogenetica è emersa come uno strumento utile sia per esplorare la dinamica delle reti neuronali sia per trattare condizioni neurologiche come l’epilessia.

La strategia optogenetica si basa sull’espressione, in aree specifiche del cervello, di proteine fotosensibili chiamate opsine, capaci di modificare il potenziale di membrana in risposta a un’illuminazione a specifiche lunghezze d’onda, solitamente ottenuta mediante l’uso di fibre ottiche invasive. Nonostante i numerosi vantaggi di questa tecnica, essa presenta ancora sfide pratiche e di trasferibilità clinica, dovute alle difficoltà di illuminare aree cerebrali multiple e profonde. In questo contesto, la ricerca di sorgenti luminose alternative rappresenta un’esigenza ancora insoddisfatta.

Le luciferasi sono enzimi in grado di emettere luce dopo l’aggiunta del loro substrato, la coelenterazina, e possono essere utilizzate per fornire luce generata endogenamente alle opsine, modulandone l’azione in modo non invasivo.

In questo progetto, intendiamo sviluppare una nanomacchina chemo-optogenetica a ciclo chiuso, denominata pHIL (pH-sensitive inhibitory luminopsin), capace di percepire i cambiamenti di pH extracellulare verso valori acidi associati all’attività epilettica e di silenziare ottogeneticamente i neuroni eccitatori per inibire la generazione delle crisi.

Infatti, l’attività epilettica provoca uno spostamento del pH extracellulare verso l’acidosi, che a sua volta aggrava l’iper-eccitabilità stimolando i canali ionici sensibili agli acidi. È stata progettata una sonda chimerica tripla, pHIL, in cui una variante bioluminescente della luciferasi di Renilla (RLuc8) è accoppiata a un sensore fluorescente di pH (una mutazione della EGFP, denominata E2GFP) e all’opsina inibitoria eNpHR3.0.

Nella strategia proposta, in condizioni di pH acido evocato dall’iper-eccitazione, l’emissione di fluorescenza di E2GFP, eccitata dalla luce UV endogena prodotta da RLuc8, aumenterà, attivando così eNpHR3.0, la quale indurrà una corrente di uscita iperpolarizzante capace di ritardare o silenziare l’attività epilettica.

Una prima chimera, pHIL1.0, è già stata ingegnerizzata ed espressa in linee cellulari e in neuroni ippocampali primari. Sulla base dei dati preliminari promettenti, intendiamo:
(i) ottimizzare la chimera per migliorare il trasferimento energetico tra i suoi componenti;
(ii) studiare l’attivazione dell’opsina inibitoria da parte del pH acido in linee cellulari e neuroni primari;
(iii) esprimere pHIL nell’ippocampo e analizzarne le risposte all’attività epilettiforme in sezioni cortico-ippocampali;
(iv) testare l’efficacia di pHIL in vivo su crisi tonico-cloniche indotte da farmaci e in modelli sperimentali di epilessia genetica.

Proponiamo pHIL come una nanomacchina a ciclo chiuso autonoma a livello cellulare, in grado di contrastare l’iper-eccitabilità neuronale e ristabilire l’omeostasi delle reti neurali nelle forme di epilessia farmacoresistente.

English version:

Epilepsy is a neurological disorder characterized by repeated seizures. Several therapeutic approaches are available but, unfortunately, around 30% of patients do not respond to medical therapies. In the last decade, optogenetics has emerged as a tool to both explore neuronal networks dynamics and to treat neurological conditions such as epilepsy. The optogenetic strategy is based on the expression, in precise brain areas, of light-sensitive proteins called opsins that are able to change the membrane potential upon wavelength-specific illumination, usually achieved using invasive optical fibers. Despite the many advantages of this technique, it still faces practical and translational challenges because of the difficulties of illuminating multiple and deep areas of the brain. In this scenario, the search of alternative light sources is an unmet need. Luciferases are enzymes able to emit light upon addiction of their substrate coelenterazine and can be used to deliver endogenously generated light to opsins and modulate their action non-invasively. In this project, we aim to develop a closed-loop chemo-optogenetic nanomachine called pHIL (pH-sensitive inhibitory luminopsin) that senses the extracellular acidic pH shifts associated with epileptic activity and optogenetically silences excitatory neurons to inhibit seizure generation. In fact, seizure activity leads to an extracellular pH shifts toward acidosis, which in turn aggravates hyperexcitability by stimulating depolarizing acid-sensing ion channels. A triple chimeric probe pHIL has been designed in which a bioluminescent variant of Renilla luciferase (RLuc8) is coupled to a fluorescent pH sensor (EGFP mutant, called E2GFP and the inhibitory opsin eNpHR3.0. In the proposed strategy, under acidic pH evoked by hyperexcitation, the fluorescence emission of E2GFP excited by endogenous RLuc8 UV-light will increase, in turn activating eNpHR3.0 to actuate a hyperpolarizing outward current that delays/silence epileptic activity. A first pHIL1.0 chimera has already been engineered and expressed in cell lines and primary hippocampal neurons. On the basis of promising preliminary data, we will: (i) optimize the chimera for optimal energy transfer between its building blocks; (ii) study the activation of the inhibitory opsin by the acidic pH in cell lines and primary neurons; (iii) express pHIL in the hippocampus and study pHIL responses to epileptic-like activity in cortico-hippocampal slices; (iv) test the efficacy of pHIL in vivo on drug-evoked tonic-clonic seizures and in experimental models of genetic epilepsy. We propose pHIL as a cell-autonomous close-loop nanomachine to counteract neuronal hyperexcitability and restore neural network homeostasis in drug-resistant epilepsy.

Contatti: fabrizia.cesca@unipd.it